Анализ состава камней из желчного пузыря

Согласно проведенным исследованиям, в
настоящее время по частоте возникновения желчнокаменная болезнь выходит на первое
место среди заболеваний пищеварительной системы. В
России частота желчнокаменной болезни находится на уровне среднеевропейских
показателей — около 10%. Заболеваемость
населения Тверской области по отдельным классам болезней: болезни органов пищеварительного
тракта (таб.№1 и диагр.№1).

Таблица №1 Болезни органов
пищеварения

Диаграмма №1

Заболеваемость населения (по основным
классам болезней) по некоторым регионам Центрального Федерального Округа в 2010
году: в Тверской области на 1000 населения всего: 922,9, из них 40,8 — болезни
органов пищеварительного тракта, т. е. 4,42%. [1] Отметим только, что это лишь
число зарегистрированных случаев желчнокаменной болезни (ЖКБ). В большинстве
случаев болезнь на начальных стадиях протекает бессимптомно и обнаруживается
случайно при ультразвуковом исследовании органов брюшной полости по поводу
сопутствующего заболевания. Поэтому, реальное число больных  ЖКБ значительно больше. Течение ряда
заболеваний сопровождается холелитиазом. При циррозах печени желчные камни
выявляют у 30% больных. Высказывается мнение, что лица с HbsAg имеют повышенный
риск образования желчных камней. Заболевания тонкой кишки с локализацией
патологического процесса в терминальном отделе приводят к нарушению
энтерогепатической циркуляции желчных кислот и, как следствие, к дисхолии. При
болезни Крона с преимущественной локализацией в терминальном отделе тонкой
кишки частота камнеобразования достигает 26,4%. При этом нет различия в частоте
формирования желчных камней между мужчинами и женщинами, а также характерной для
ЖКБ возрастной зависимости [16]. На степень риска камнеобразования влияют
локализация и обширность резекции тонкой кишки по поводу различных заболеваний.
Субтотальная и тотальная гемиколэктомия также увеличивает риск образования
желчных камней. При синдроме нарушенного всасывания тяжелой степени (глютеновая
энтеропатия, резекции тонкой кишки, болезнь Крона и др.) изменяются все
основные виды обмена, в том числе и всасывание желчных кислот, что способствует
камнеобразованию.

После 40 лет желчные камни находят у 32%
женщин и 16% мужчин, при этом в 30% случаев отмечают инфицирование желчи. В
основе камнеобразования лежит нарушение равновесия между стабилизаторами желчи
(желчные кислоты и лецитин) и количеством растворенных в ней веществ (карбонат
кальция, билирубин и холестерин). Матрицей
для камнеобразования являются белки желчи, кристаллы холестерина или
билирубина. Одним из наиболее значимых и идентифицированных пронуклеаторов
является муцин-гликопротеиновый гель. Следует отметить, что в норме муцин
постоянно секретируется слизистой оболочкой желчного пузыря, однако его
секреция повышается при наличии литогенной желчи. К белкам, ускоряющим
осаждение холестерина, кроме муцина относят N-аминопептидазу, кислый
α1-гликопротеин, иммуноглобулины, фосфолипазу С; к антинуклеаторам — аспирин и
другие НПВС. Аполипопротеины А1 и А2 замедляют осаждение холестерина. При этом
похудание сопровождается увеличением содержания муцина и кальция в пузырной
желчи и тем самым способствует образованию желчных камней. [2, 6, 7, 16]

Желчные камни —
плотные конкременты, образующиеся в желчном пузыре и желчных протоках. Они
бывают размером от песчинки (рис.№1) до куриного яйца (рис.№2).

Рис. №1: множественные, мелкие желчные камни смешанного типа.

Рис. №2: множественные, крупные желчные камни с темным ядром.

Рис.
№3: множественные, крупные желчные камни

однородной
структуры.

В центре камня в
большинстве случаев находится холестерин, реже — слущенный эпителий стенки
пузыря, пропитанный солями кальция, магния, пигментом и белками.[6, 9]

По составу желчные камни делятся на
холестериновые, пигментно-холестериновые, сложные
холестерино-пигментные-известковые, пигментные и известковые. [10]

Холестериновые
камни состоят в основном из холестерина с незначительной примесью белка,
извести и пигментов. Эти камни чаще округлой формы, белесовато-желтоватого
цвета, гладкие, легкие, плавают в воде, легко горят и сгорают без остатка. Чистый
холестериновый камень может превратиться в пигментно-холестериновый и
холестерино-пигментно-известковый, 
однако центральная часть его всегда состоит из чистого холестерина. Сложные
холестерино-пигментно-известковые камни — наиболее частый вид желчных камней.
Они имеют цвет от белесовато-сероватого до черного. Ядро их состоит из
пигментов и холестерина. Пигментные камни чаще всего образуются вследствие
застоя желчи в печени, внепеченочных желчных путях. Они множественные, мелкие,
диаметром до 1-1,5 см,
мягкой консистенции, на разрезе гомогенны, буровато-черного цвета. Зачатки этих
камней образуются во внутрипеченочных желчных ходах в виде белковой основы,
желчных пигментов и незначительной примеси известковых солей. [8, 9] Известковые
камни — плотные белесоватые бугристые образования. Эти камни встречаются очень
редко. [6, 7, 8, 9]

Известно,
что желчные камни обладают кумулятивными свойствами, т.е. способны накапливать вещества,
содержащиеся в окружающей среде даже в незначительных количествах. [2, 8] В
настоящее время в подавляющем большинстве случаев диагностирования
желчнокаменной болезни назначается оперативное лечение, и конкременты, изъятые
из желчного пузыря, становятся доступными для исследования лишь по прошествии
операции, поэтому их химическому анализу практически не уделяется внимания. В
то же время, их состав мог бы служить дополнительным диагностическим тестом при
определении характера нарушения обмена веществ и определения постоперативного
лечения прооперированных пациентов, что может помочь в поиске новых, нехирургических
методов лечения или предотвращения желчнокаменной болезни.

К
числу веществ, способных растворять выпадающие в водных средах осадки, а также
предотвращать их выпадение, относятся комплексоны. [11] Химические и физические
свойства комплексонов хорошо изучены, однако мало исследована их биологическая
активность.

Комплексоны
— органические вещества (главным образом аминополикарбоновые кислоты и их
соли), образующие с ионами металлов стойкие водорастворимые комплексы.

Комплексы с ионами кальция, магния и других металлов безвредны для человека
и других живых существ и растворимы в воде. Самым известным из комплексонов
является этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТУК). В последние десятилетия наряду
с ЭДТУК в возрастающих масштабах используется ее более новый экологически
безопасный аналог — этилендиаминдиянтарная кислота (ЭДДЯК).

На первом этапе представленного исследования была предпринята попытка
растворения желчных камней в растворах комплексонов: ЭДТУК и ЭДДЯК,
подщелоченных NaOH до рН=5,6. Навески желчных камней, по внешнему виду
отнесенных к трем разным типам, помещали в 0,05М растворы ЭДТУК и ЭДДЯК (рис.№4).

Рис. №4: желчные камни в растворах комплексонов.

1.1, 1.2, 1.3 — раствор ЭДТУК. 2.1, 2.2, 2.3 — раствор ЭДДЯК.

Как и предполагалось, холестерино-пигментные камни ни через 7 дней, ни
через месяц не претерпели видимых изменений (рис.№5).

Рис. №5: холестерино-пигментные камни в растворах

ЭДТУК (1.1) и ЭДДЯК (2.1) через месяц.

Уменьшились в размерах или распались на части лишь смешанные камни со
значительной минеральной составляющей (рис.№6).

Рис. №6: смешанные камни в растворах ЭДДЯК(2.2, 2.3) через месяц.

При этом возник вопрос о том, какова частота образования конкрементов с
неорганической составляющей и какие металлы, способные хелатироваться
комплексонами, входят в их состав. С этой целью по стандартным методикам была
определена зольность образцов желчных камней тридцати пациентов, прооперированных
в Первом хирургическом отделении Областной клинической больницы (ОКБ) г. Твери в
октябре 2010 года.

Рис. №7: зольные остатки желчных камней.

Зольность образов представлена на диаграмме №2.

Диаграмма №2: Уровень зольности образцов желчных камней (ω,%).

Зольные остатки (Рис. №7) были растворены в концентрированной азотной
кислоте и проанализированы методом комплексонометрического титрования на
содержание Ca2+, Mg2+. [12] Конкременты с высоким
содержанием Ca2+, Mg2+ были растворены в растворе
лимонной кислоты. Растворимость желчных камней смешанного типа с высоким
содержанием минеральной составляющей в растворе лимонной кислоты оказалась выше
чем в растворах комплексонов, но в то же время раствор лимонной кислоты имеет
сильнокислую среду (рН), поэтому его использование в качестве растворителя не
представлялось возможным для расстворения желчных камней у больных ЖКБ.

Лимонная кислота,
являющаяся естественным метаболитом и важнейшим звеном цикла тканевого дыхания,
давно известна и хорошо изучена. В присутствии кальция лимонная кислота
образует с ним устойчивый комплекс — цитрат кальция, который растворим в воде,
и легко усваивается организмом человека. Выведение кальция и его соединений,
магния и других металлов из состава камней приводит к их распаду[2, 3].

Быстрый метаболизм и поглощение тканями лимонной кислоты, сильнокислая pH среды раствора, большая потребность в ней других
тканей — делают невозможным доставку лимонной кислоты до печени и желчного
пузыря для растворения желчных камней, поэтому она не могла использоваться
ранее  для эффективного лечения ЖКБ.

Предлагаемая нами, липосомальная форма лимонной кислоты позволяет доставить
лимонную кислоту практически в неизмененном виде до клеток печени и,
соответственно, до желчи. Липосомальные препараты представляют собой липидные
везикулы размером порядка 100 нанометров из одного или нескольких слоев
фосфолипидов, содержащие действующее лекарственное начало и водную фазу.
Липосомы относятся к системам пассивной адресной доставки, так как обладают
высокой тропностью (более 80%) к органам ретикулоэндотелиальной системы (РЭС),
т.е. к печени и селезенке. Такая форма позволяет применять препарат как через
желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), так и парентерально, так как не меняет pH среды, защищает слизистые ЖКТ от кислой среды
лимонной кислоты за счет фосфолипидной оболочки.

При любом виде введения (перорально или парентерально), липосомы
стремительно доставляют вещество в тропные органы (печень — через 15 мин.) и
постепенно распадаются уже в клетках органа, что обеспечивает быстрое и
пролонгированное действие вещества. В клетке печени липосома распадается и
высвобождает лимонную кислоту. Часть лимонной кислоты используется
непосредственно самой клеткой для процессов клеточного метаболизма, часть —
поступает в желчь и с ней в желчный пузырь. Также, часть фосфолипидов,
образующих липосомы, при распаде в клетках печени не разрушаются, а
встраиваются в поврежденные участки клеточной стенки, обеспечивая тем самым
гепатопротекторный эффект, обновляют клеточную стенку, достраивают поврежденные
участки.

Массовые доли металлов (%), обнаруженных в желчных камнях с зольностью
>1%, (№16 — №30) представлены на диаграмме №3.

Диаграмма №3: Содержание металлов в желчных камнях с зольностью >1%.

Образцы с зольностью >10% были проанализированы на содержание Sr2+. Присутствие  Ca2+ было обнаружено в 28 образцах из 30-ти, Mg2+ — в 27, Sr2+ — в 5-ти. Все 28 образцов с зольностью >0 были
проанализированы на содержание железа. Этот металл был обнаружен и
количественно определен фотометрически (фотометр КФК-3) в форме роданидного
комплекса лишь в 4-х образцах желчных камней. В конкрементах из всех 4-х
обнаруженных металлов преобладает Ca2+ , в меньшем количестве
содержится Mg2+. В конкрементах с высокой зольностью содержатся десятые
доли процента Sr2+ (лишь в 1-м образце >1%), что может служить
доказательством гипотезы о выведении части Sr2+, поступающего с пищей (0,8-3мг/сут.) не только через почки, но и с желчью.[4]
По-видимому, в некоторых случаях желчные камни могут кумулировать Sr2+.

Железо, обнаруженное в 4-х образцах, содержится в сотых долях процента.

На
следующем этапе исследования был проведен анализ органической составляющей
камней с помощью методов ИК-спектроскопии (инфракрасной спетроскопии). Инфракрасная спектроскопия
с использованием специального прибора (Thermo scientific iS10 Nicolet с приставкой Smart iTR с кристаллом ZnSe) является одним из методов
исследования состава сложных многокомпонентных веществ, биосубстратов и
биологических жидкостей которые не требуют предварительной длительной
подготовки исследуемой пробы.

Образцы
высушенных желчных камней растирали в агатовой ступке до получения однородной
смеси (рис. №8).

Рис. №8: растертый в агатовой ступке желчный камень.

Полученные
на спектрах пики совмещены с возможным химическим составом. Анализ спектров
показал (рис. №9) наличие холестерина, характеризующегося большими растяжениями
полос О-Н групп 3365.4 см-1, С-Н валентные колебания 2933 см-1,
СН симметричное растяжение СН3 2899 см-1, СН симметричное
растяжение СН2 2865  см-1,
СН изгиб СН2 1462 см-1 связан с деформацией кольца
холестерина.  Кальция билирубинат имеет
характерные полосы 1254 см-1, это характерные растяжения СОС, ССН в
плоскости изгиба 1222. 5 см-1. Пики на 984 свидетельствуют о наличии
виниловых полимеров, например, билирубина. 
Наличие апатитов характеризуется пиками 1228 см-1. Апатиты
относятся к классу фосфатов. Карбонаты кальция — 1438 см-1, СО изгиб
в СаСО3 — 838 см-1. Карбонаты кальция имеют три
естественных полиморфных состояния: кальцит (1438 см-1), арагонит(699 см-1), фатерит(740 см-1). Фосфаты — 1248
см-1. Наличие амид I
подтверждается в области  1650 см-1,
амид II 1544 см-1.
Наличие Амидных связей, свидетельствует о присутствии в составе исследуемой
пробы белковых структур. Спектральные характеристики моногидрата оксалата
кальция найдены в камнях на 882 см-1[13, 15]. Полученные спектры
дают возможность охарактеризовать желчные камни по преобладанию в их составе тех
или иных веществ и разработать в дальнейшем приемлемую тактику консервативного
лечения ЖКБ.

Так,
например, при больших пиках холестерина на спектре целесообразно использовать
для консервативной терапии ЖКБ препараты производных желчных кислот (ХДХК,
ДХК). А при наличии пиков минеральных компонентов консервативная терапия этими
препаратами противопоказана. Исходя из вышесказанного, разработка липосомальной
формы лимонной кислоты — как растворителя желчных камней смешанного типа,
откроет в будущем широкие возможности для консервативного лечения ЖКБ при
диагностировании минеральных и смешанных камней со значительной минеральной
составляющей.

Концентрация
вещества определяется по площади пика[14].

Рис. №9: инфракрасный спектр образца желчного камня №36 с обозначенными
пиками. Число сканов пробы: 64. Число сканов сравнения: 64. Разрешение: 4,000
см-1. Усиление: 8,0. Скорость зеркала: 0,4747. Диафрагма: 80,00.
Проведена коррекция базовой линии.

Таким образом, 50% проанализированных нами желчных конкрементов с
зольностью <1% — холестериновые камни. Их образование связано с нарушением
холестеринового обмена в организме. Консервативное лечение при таком типе ЖКБ
возможно препаратами производных желчных кислот. Неорганическая составляющая
желчных камней помимо Ca2+ и Mg2+ может содержать ионы Fe и Sr, что может служить доказательством теории о
кумулятивных свойствах желчных камней и гипотезы о выведении  Sr не только через почки, но и через билиарный тракт. Способность
комплексонов растворять минеральную составляющую желчных камней может быть
исследована в качестве одного из компонентов препарата для консервативного
лечения ЖКБ при камнях смешанного типа со значительной минеральной
составляющей. Растворяющая способность лимонной кислоты при воздействии на
желчные камни смешанного типа с 
незначительной минеральной составляющей может быть использована для
разработки препарата липосомальной формы лимонной кислоты с пассивной адресной
доставкой лимонной кислоты до органов РЭС (печень и селезенка) и ее
преимущественной концентрацией в печени и соответственно в желчи. Создание
такого препарата позволит использовать консервативную терапию при большом числе
случаев ЖКБ со смешанным типом камней и существенно уменьшит число оперативных
вмешательств по поводу ЖКБ.

Разработка и исследования липосомальной формы лимонной кислоты — предмет
следующего этапа исследований в этом направлении.