Her2 neu при раке желудка

Исследование, проводимое с целью оценки метастатического потенциала опухоли и подбора терапии при раке молочной железы (РМЖ) или раке желудка (РЖ).

HER2 (HER2/neu) — human epidermal growth factor receptor-2 — представитель семейства рецепторов эпидермального фактора роста человека. Гиперэкспрессия HER2 при некоторых подтипах РМЖ ведет к усилению пролиферации и ангиогенеза, нарушению регуляции апоптоза (генетически запрограммированного самоуничтожения клеток). Показано, что при РМЖ гиперэкспрессия этого рецептора в ткани опухоли ассоциирована с более агрессивным течением болезни, повышенным метастатическим потенциалом опухоли и менее благоприятным прогнозом. Открытие связи гиперэкспрессии HER2 с неблагоприятным прогнозом РМЖ привело к поиску таких подходов к лечению, которые направлены на специфическое блокирование онкогена HER2/neu (таргетная анти-HER2-терапия).

Рак молочной железы (РМЖ)

Смертность от РМЖ за последние 20 лет значительно снизилась, что обусловлено как появлением новых лекарственных средств, так и улучшением скрининга и более раннего выявления опухолей. Тем не менее, РМЖ является наиболее частым злокачественным новообразованием у женщин. В структуре смертности женщин от злокачественных новообразований в России в 2011 году РМЖ занимал лидирующее место (17,3%). 

В зависимости от наличия биологических маркеров опухоли — экспрессии гормональных рецепторов (эстрогена и/или прогестерона), экспрессии HER2 — выделяют гормон-рецептор-положительный, HER2-положительный и тройной негативный РМЖ. Большинство раковых опухолей молочной железы являются гормонально-зависимыми: эстрогены и прогестерон оказывают на них стимулирующий эффект (пролиферативный и неопластический) (см. тест «Рецепторы эстрогенов и прогестерона, иммуногистохимическое исследование»). При HER2-положительном раке молочной железы на поверхности опухолевых клеток присутствует избыток HER2-рецепторов. Данное явление носит название «положительный HER2-статус» и диагностируется у 15 20% женщин, страдающих РМЖ. 

HER2 — рецептор эпидермального фактора роста человека 2-го типа, который присутствует в тканях и в норме, участвуя в регуляции деления и дифференцировки клеток. Его избыток на поверхности опухолевых клеток (гиперэкспрессия) предопределяет быстрый неконтролируемый рост новообразования, высокий риск метастазирования, низкую эффективность некоторых видов лечения. HER2-положительный РМЖ (ИГХ 3+) является особенно агрессивной формой данного заболевания, поэтому точное определение HER2-статуса имеет ключевое значение для выбора тактики лечения. Иммуногистохимическое определение HER2-статуса применяется как базовое тестирование. При неопределенном результате (ИГХ 2+), для подтверждения HER2-статуса необходимо провести исследование методом гибридизации in situ (ISH). 

Основным методом лечения РЖ является хирургический. Однако у большинства пациентов на момент постановки диагноза определяется распространенный опухолевый процесс, что делает невозможным выполнение радикальной операции и требует проведения системной лекарственной терапии. Проведение химиотерапии статистически достоверно увеличивает общую выживаемость больных метастатическим РЖ, улучшая качество их жизни. 

Онкоген HER2 (erbB-2) был первоначально идентифицирован в опухолях молочной железы. Амплификация и гиперэкспрессия данного гена является относительно специфическим событием для карцином молочной железы и практически не встречается в опухолях других локализаций. Рак желудка представляется одним из немногих исключений: активация HER2 отмечается примерно в 10 15% злокачественных новообразований этого органа и коррелирует с агрессивным течением заболевания. 

Гиперэкспрессия HER2 является фактором неблагоприятного прогноза. По данным разных исследований, амплификация гена HER2 у больных РЖ коррелирует с низкими показателями общей выживаемости. 

Для оценки HER2-статуса при РЖ используют методики, принятые при РМЖ (ИГХ, флюоресцентная гибридизация in situ — FISH), однако опухоли желудка отличаются более высокой частотой неполного мембранного окрашивания при ИГХ по сравнению с опухолями молочной железы. Иммуногистохимическое определение HER2-статуса является валидированным методом.

Литература

1. Злокачественные заболевания в России в 2011 году (заболеваемость и смертность). — Ред. Чиссов В. И., Старинский В. В., Петрова Г. В.- М.: ФГБУ МНИОИ им. П. А. Герцена Минздрава России. — 2013.- 289 с. 
2. Онкология. Клинические рекомендации. Ассоциация онкологов России. – Ред. Чиссов В. И., Дарьялова С. Л.- М., ГЭОТАР-Медиа, 2008, 702 с. 
3. Состояние онкологической помощи населению России в 2012 году. Под ред. А. Д. Каприна, В. В. Старинского, Г. В. Петровой. — М.: ФГБУ «МНИОИ им. П. А. Герцена» Минздрава России, 2013.- 232 с. 
4. Bang Y.J. and Van Cutsem E., et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet 2010; 376:687-697. 
5. Ferlay J., Shin H.R., Bray F., Forman D., Mathers C. and Parkin D.M. GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC Cancer Base No. 10 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010. Available from: https://globocan.iarc.fr.
6. Park D.I., Yun J.W., Park J.H., et al: Her2/neu amplification is an independent prognostic factor in gastric cancer. Dig Dis Sci 2006; 51: 1371–1379. 
7. Slamon D. et al. Adjuvant Trastuzumab in HER2-Positive Breast Cancer. N Engl J Med 2011; 365:1273-83. 
8. Tanner M., Hollmén M., Junttila T.T., Kapanen A.I., Tommola S., Soini Y., Helin H., Salo J., Joensuu H., Sihvo E., et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol.2005;16:273–278. 
9. Wolff A.C. et al. American Society of Clinical Oncology/ College of American Pathologists Guideline Recommendations for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med—Vol. 131, January 2007.

[40-637]
Комплексное гистологическое и иммуногистохимическое исследование с определением HER2 статуса опухоли по экспрессии HER2/neu

5445 руб.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследование экспрессии рецептора HER2/neu — одного из наиболее значимых молекулярных маркеров при раке молочной железы, а также при раке желудка в целях подтверждения диагноза, прогноза его течения и подбора терапии.

Синонимы русские

Гистологическое исследование; иммуногистохимическое исследование (ИГХ); рецептор HER2/neu; рак желудка, онкопотенциал опухоли; рак молочной железы, онкопотенциал опухоли.

Синонимы английские

Histological analysis, immunohistochemical analysis; IHC (ImmunoHistoChemistry); receptor HER2/neu.

Метод исследования

Гистологический метод.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Образец ткани (биоптат), помещенный в формалин. Локализация: 1. Образец ткани (биоптат) опухолевого образования молочной железы; 2. Образец ткани (биоптат) опухолевого образования желудка.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Специальной подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

HER2 (HER2/neu) является рецептором эпидермального фактора роста. Многими исследованиями доказано, что наличие этого фактора при раке молочной железы ведет к усиленной пролиферации опухолевых клеток, более агрессивному течению, высокому риску метастазирования и наименее благоприятному прогнозу. Поэтому выявление этого фактора обязывает к поиску специфического лечения, назначению препаратов, прицельно воздействующих на онкоген (HER 2).

Рак молочной железы расценивается как наиболее частое онкологическое заболевание у женщин. Большинство типов рака молочной железы являются гормонзависимыми, т.е. эстрогены и прогестерон оказывают на них стимулирующий эффект. При этом типе на поверхности опухолевых клеток находится большое количество рецепторов HER2/neu.

Гиперэкспрессия рецептора HER2/neu считается достаточно специфичной для рака молочной железы и очень редко встречается при опухолях других локализаций. Одним из редких исключений является рак желудка, который также занимает одно из первых мест в структуре онкологических заболеваний. Рак желудка чаще встречается у мужчин, трудно выявляется на ранней стадии в связи с длительным скрытым течением и минимальными клиническими проявлениями. Обнаружение повышенной экспрессии HER2/neu при раке желудка, как и при раке молочной железы, считается неблагоприятным и характеризует более агрессивное течение, сложности в подборе терапии и ее эффективности, низкие показатели выживаемости.

Комплексное обследование вследствие включения в него двух информативных методов позволяет дать достаточно информативный результат. Гистологическое исследование позволяет оценить под микроскопом морфологическую структуру опухоли, изменения в клетках, распознать злокачественные они или нет, имеются ли пораженные лимфатические узлы, есть ли поражение других тканей и органов. Иммуногистохимическое исследование имеет более широкие возможности в определении степени злокачественности, риска развития метастазирования, прогноза заболевания, подбора терапии и оценке ее эффективности. ИГХ основана на образовании комплекса антиген-антитело, который образуется при добавлении к исследуемому материалу с антигенами HER2/neu антител, специфичных для них. Затем происходит количественная оценка этих комплексов, что делает возможным дать ответ на вопрос о наличии или отсутствии усиленной экспрессии HER2/neu.

Два исследования, проводимые в комплексе, дополняют друг друга и позволяют поставить более точный и полный диагноз и подобрать эффективную терапию.

Для чего используется исследование?

• Для определения наличия HER2-позитивного рака молочной железы;
• для определения характера течения рака молочной железы, его прогноза, подбора терапии и контроля уже проведенного лечения;
• для определения наличия HER-2 (HER2/neu) – рецепторов при раке желудка;
• для определения характера течения рака желудка, его прогноза, подбора и контроля терапии.

Когда назначается исследование?

• При наличии новообразований молочной железы с подозрением на злокачественные;
• при наличии рака молочной железы;
• при раке желудка.

Что означают результаты?

Результат представляет собой морфологическое описание исследуемого материала с обозначением характера изменений (в том числе наличием злокачественности) и количественную оценку гиперэкспрессии рецептора HER-2 (HER2/neu) в опухолевых клетках.

Окончательный диагноз ставится врачом на основании данных анамнеза и результатов всех проведенных исследований. 

Кто назначает исследование?

Онколог, акушер-гинеколог, маммолог, хирург, врач-генетик.

Литература

• Patel Y, Soni M, Awagulerwitsch A, Kern MJ, Liu S, Shah N, Singh UP, Chen H. Overexpression of miR-489 derails mammary hierarchy structure and inhibits HER2/neu-induced tumorigenesis. Oncogene. 2018 Aug 13.
• Hong Z, Mao X, You J, Liu Z, Shi Y. An Evaluation of HER2-Positive Ovarian Carcinoma Xenografts: From a Novel Therapy to a Noninvasive Monitoring Method. Cancer Biother Radiopharm. 2018 Jul 27.
• Baumann J, Kokabee M, Wong J, Balasubramaniyam R, Sun Y, Conklin DS. Global metabolite profiling analysis of lipotoxicity in HER2/neu-positive breast cancer cells. Oncotarget. 2018 Jun 5;9(43):27133-27150.

Рак желудка (РЖ) занимает 4-е место в мире среди впервые диагностируемых опухолей и 2-е место (после рака легкого) среди причин смерти от раковых заболеваний [1]. Ежегодно регистрируют более 1 млн больных РЖ и пищеводно-желудочного перехода. Рост заболеваемости за последние 2 десятилетия XX века превысил аналогичные показатели по другим локализациям более чем в

3 раза [2]. В России в 2012 г. впервые было выявлено 36 528 новых случаев РЖ [3]. Основным методом лечения РЖ в настоящее время является хирургическое вмешательство, в то же время у части пациентов обнаруживается значительное местное распространение или метастазы, что требует применения дополнительных методов лечения. В последние годы для лечения РЖ наряду с химиотерапией широко применяется таргетный препарат трастузумаб (Герцептин), являющийся гуманизированным моноклональным антителом, специфичным к рецептору эпидермального фактора роста человека 2-го типа (HER2). Открытое международное рандомизированное контролируемое исследование III фазы (TOGA), которое включило 122 исследовательских центра из 24 стран, показало, что применение трастузумаба в комплексной терапии пациентов с гиперэкспрессией HER2 в комбинации с капецитабином и фторурацилом при местно-распространенном РЖ приводит к достоверному увеличению продолжительности жизни пациентов. Медиана выживаемости в группе больных, получавших Герцептин в комбинации с химиотерапией, составила 13,8 мес, а в группе больных, получавших только химиотерапию, — 11,1 мес [4, 5]. Таким образом, оценка гиперэкспрессии/амплификации HER2 имеет важное значение для проведения адекватного таргетного лечения распространенного РЖ и пищеводно-желудочного перехода.

По классификации ВОЗ, РЖ включает несколько гистологических типов: аденокарциному (папиллярная, тубулярная, муцинозная; высоко-, умеренно-, низкодифференцированная), перстневидно-клеточный рак, железисто-плоскоклеточную карциному, плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак и недифференцированную карциному. Также применяется классификация Р. Lauren [6], в которой все злокачественные опухоли желудка подразделяются на 2 типа: интестинальный и диффузный. По результатам исследования TОGA, РЖ с положительным HER2-статусом встречается в 16-22% случаев. Опухоли с положительным HER2-статусом встречаются с одинаковой частотой как в Европе, так и в Азии (23,6 и 23,5% соответственно) [4, 5]. При кишечном типе положительные по HER2-статусу опухоли выявлены в 32,3% случаев, при диффузном типе — в 6,1%, при смешанном типе — в 20,4% [4, 5]. По данным Y. Janjigian и соавт. [7], гиперэкспрессия HER2 встречается практически вдвое чаще при интестинальном типе аденокарциномы желудка, чем при диффузном или смешанном типе. Авторы показали, что выживаемость в группах с гиперэкспрессией HER2 оказалась выше, чем в группах без гиперэкспрессии (13,9 и 11,4 мес соответственно). Интересно, что в группе интестинальных аденокарцином медиана выживаемости у HER2-положительных пациентов выше, а в группе диффузных аденокарцином ниже, чем у больных с HER2-негативным статусом [7].

Для максимальной эффективности таргетного лечения трастузумабом необходимо очень точное и аккуратное предварительное исследование HER2-статуса карциномы желудка. Для его оценки разработано несколько методов: иммуногистохимический (ИГХ) — определение количества белка HER2 на клеточной поверхности — и гибридизация in situ (ГИС) — использование ДНК-зондов, меченных флюоресцентными или хромогенными метками, которая выявляет амплификацию гена HER2. По данным исследования TОGA, корреляция гиперэкспрессии белка и амплификации гена HER2 составляет 87,5%.

Для проведения ИГХ-исследования применяются коммерческий стандартизованный набор HercepTest («Dako») или антитела Pathway anti-HER2, клон 4B5 («Ventana»), для ГИС-флюоресцентная используют диагностический набор HER2 FISH Pharm Dx Kit («Dako», Glostrup, Дания), а для ГИС, усиленная серебром, INFORM HER2 DNA — SISH («Ventana»/«Roche»).

Для оценки гиперэкспрессии HER2 в клетках РЖ и желудочно-пищеводного перехода под руководством профессора F. Hofmann были разработаны критерии оценки, которые отличаются от критериев, применяющихся при раке молочной железы [8]. Они учитывают значительную гетерогенность карцином желудка, которая проявляется не только в гистологическом строении, но и в молекулярно-биологических характеристиках. Необходимо подчеркнуть, что при РЖ эти критерии различаются для операционного и биопсийного материалов [8]. Так, для биопсийного материала принято считать опухоль с положительным HER2-статусом при наличии яркого мембранного окрашивания 5 опухолевых клеток, образующих кластер. Значительная гетерогенность опухолей желудка диктует необходимость взятия при биопсии не одного кусочка ткани, а не менее 6-8. Поэтому важно знать, насколько адекватно результаты исследования биопсийного материала, содержащего нередко небольшой объем опухолевых клеток, отражают истинные молекулярно-биологические особенности конкретной опухоли. Исследования, посвященные этой проблеме, немногочисленны и выполнены, преимущественно, на малых группах пациентов. В работе G. Gasljevic и соавт. [9] совпадение HER2-статуса в биопсийном и операционном материале было выявлено в 84,9% случаев, по данным M. Pirrelli и соавт. [10], — в 91,8%, в исследовании F. Grillo и соавт. [11] — 89%, в работе S. Watson и соавт. [12] (крупное клиническое исследование GERCOR, проведенное на 228 пациентах) — в 95,6%. В России многоцентровое исследование HER2-статуса РЖ было начато в 2010 г., но результаты совпадения экспрессии/амплификации HER2 в биопсийном и операционном материале не анализировались.

Цель настоящей работы — исследование конкордантности определения HER2-статуса в биопсийном и операционном материале при РЖ.

Материалом для исследования послужил биопсийный и операционный материал, полученный в отделении патологической анатомии Рязанского областного онкологического диспансера и на кафедре патологической анатомии РМАПО Минздрава России. Всего были исследованы 346 пациентов (206 мужчин и 140 женщин). Возраст больных варьировал от 36 до 83 лет (средний — 62,5 года). В группах с наличием гиперэкспрессии HER2 и без нее средний возраст пациентов практически не различался. Были выделены 3 группы по локализации опухоли: группа с локализацией рака в проксимальном отделе желудка, группа с дистальным расположением опухоли и группа с субтотальным поражением желудка. В исследованных опухолях аденокарцинома кишечного типа выявлена в 98 (28,3%) случаях, диффузного типа — в 112 (32,4%), смешанного типа — в 63 (18,2%), перстневидно-клеточная карцинома — в 71 (20,5%) случае. Материал фиксировали 10% нейтральным формалином в течение 24 ч, затем заливали в парафиновые блоки. Для ИГХ- и ГИС-исследований готовили срезы толщиной 4 мкм.

ИГХ-анализ проводили с использованием наборов HercepTest («Dako», Дания) и Pathway anti-HER2, клон 4B5 («Ventana»), FISH — с использованием набора HER2 FISH Pharm Dx Kit («Dako», Дания). SISH выполняли на приборе Benchmark Ultra («Ventana Medical Systems», Tucson, AZ, США) набором INFORM HER2 DNA («Ventana»). Все наборы применяли согласно протоколу производителя с обязательным использованием контрольных стекол. Оценку окрашивания мембран на ИГХ-препаратах проводили согласно рекомендациям М. Hofmann и соавт. [8] для операционного и биопсийного материала. FISH- и SISH-препараты оценивали согласно инструкциям к наборам, подсчитывая метку в 20/40 ядрах опухолевых клеток с увеличением в 400 и 1000, после чего вычисляли соотношение HER2:CHR17. При соотношении HER2:CHR17 <2, считали, что амплификация гена HER2 не выявлена, при соотношении HER2:CHR17 >2 наличие амплификации считали установленным.

В группу с положительным HER2-статусом были отнесены опухоли с наличием гиперэкспрессии (3+) или амплификацией гена HER2, в группу с отрицательным статусом — все остальные случаи.

Определение HER2-статуса опухоли по биопсийному и операционному материалу показало, что из 346 исследованных образцов РЖ 309 (89,3%) оказались отрицательными и 37 (10,7%) — положительными. В общей выборке разница между мужчинами и женщинами с положительным HER2-статусом практически отсутствовала (10,3 и 11,3% соответственно). В группе больных с дистальным расположением опухоли гиперэкспрессия этого маркера встречалась достоверно чаще у женщин (10,5%), чем у мужчин (5,26%). В то же время при проксимальном расположении рака и субтотальном поражении у мужчин чаще выявлялись опухоли с положительным HER2-статусом (20,7% против 14,2% в группе проксимального поражения и 14,3% против 12,2% при субтотальном поражении) (табл. 1, рис. 1)Таблица 1. Распределение HER2-позитивных карцином различных гистологических типов по локализации опухоли в желудке (%)..

Анализ уровня экспрессии HER2 в зависимости от гистологической формы рака показал, что в диффузном типе положительные случаи встречаются реже, чем в кишечном или смешанном и не зависят от локализации опухоли (табл. 2, 3). В кишечном типе HER2-позитивные опухоли выявлены в 21,4% случаев, в диффузном типе — в 6,1%, в смешанном — 15,9%. Эти данные согласуются с результатами исследований ряда других авторов, проведенных на других выборках [4, 5, 11]. Частота случаев с положительным HER2-статусом в нашем исследовании прямо коррелировала со степенью дифференцировки РЖ. HER2-позитивный рак встречался чаще среди высокодифференцированных опухолей — в 7 (36,8%), среди умереннодифференцированных — в 11 (10,8%), низкодифференцированных — в 18 (10,9%) случаев. В группе перстневидно-клеточных карцином опухолей с положительным HER2-статусом выявлено не было (см. табл. 1, 3, 4, рис. 2)Рисунок 2. Распределение HER2-позитивных карцином в зависимости от локализации опухоли и степени ее дифференцировки (%).

Таким образом, количество опухолей с положительным HER2-статусом в нашей выборке в целом составило примерно 11% и оказалось несколько ниже, чем по данным литературы [4, 5]. Это может быть связано с большим числом опухолей диффузного типа и перстневидно-клеточного рака, присутствующих в нашей выборке (см. табл. 2). Результаты в группах кишечного типа и высокодифференцированных аденокарцином сходны с результатами, полученными в многоцентровом исследовании TОGA.

Сравнительный анализ результатов HER2-тестирования на биопсийном и операционном материале 346 случаев показал, что расхождение результатов получено в 51 (14,7%) случае. Однако истинное расхождение по HER2-статусу опухоли было выявлено только в 3 случаях, что составило менее 1% (0,87%). В этих 3 образцах в биопсийном материале HER2-статус был определен как отрицательный, а при исследовании операционного материала — положительный (в одном случае в биопсийном материале экспрессия 0, в операционном материале 3+; в одном случае 1+ в биопсии был изменен на 3+ в операционном материале и в одном случае 1+ изменен на 2+ с наличием амплификации). Наибольшие расхождения в результатах ИГХ-определения экспрессии HER2 оказались в группах с экспрессией 0 и 1+ (табл. 5, рис. 3)Рисунок 3. Сравнительный анализ экспрессии HER2 в биопсийном и операционном материале (ИГХ-исследование с антителами к HER2/neu. ×200). а — аденокарцинома желудка, биопсийный материал, позитивный HER2-статус, 3+; б — аденокарцинома желудка, операционный материал, позитивный HER2-статус, 3+. Интенсивное равномерное мембранное окрашивание; в — аденокарцинома желудка, биопсийный материал, негативный HER2-статус, 0; г — аденокарцинома желудка, операционный материал, гетерогенная реакция в клетках опухоли, балльная оценка 3+ (более 10% клеток)..

Но данные различия в результатах не изменяют HER2-статус опухоли и не влияют на назначение схемы лечения. При определении положительного статуса опухоли (ИГХ 3+) различия в статусе, определенные по биопсийному и операционному материалу, практически отсутствуют (см. табл. 5). По мнению ряда авторов [10-12], различия в определении HER2-статуса в основном связаны с гетерогенностью опухоли, поэтому в биопсийный материал могут попадать участки опухоли, не полностью отражающие ее свойства [11]. Повторный анализ качества биопсий нашего материала, в которых были выявлены расхождения, показал, что в двух из них количество кусочков было 3-5 (меньше рекомендованных 6-8). Вероятно, это и оказалось причиной полученных не конкордантных результатов.

Исследование, проведенное на большой российской выборке (346 пациентов), показало наличие положительного HER2-статуса в 10,7% изученных образцов. В аденокарциномах кишечного типа положительный HER2-статус выявлен в 21,4% случаев. Сравнительный анализ определения HER2-статуса в биопсийном и операционном материале показал, что различия в определении HER2-статуса опухоли выявляются менее чем в 1% изученных образцов. Остальные выявленные различия (14,7%) не меняют HER2-статус опухоли и, следовательно, не влияют на выбор схемы лечения. Таким образом, HER2-статус опухоли, определенный на биопсийном материале, достоверно отражает молекулярно-биологические свойства РЖ и может использоваться в клинической практике для определения показаний к применению таргетных препаратов при местно-распространенных и генерализованных опухолях.

Статья подготовлена при поддержке компании «Ф. Хоффманн-Ля Рош Лтд.» (Швейцария).

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Г.А.Ф., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Сбор и обработка материалов: Л.Э.З., Ю.Ю.А.. И.Ю.В., Н.В.Д.

Статистическая обработка: О.А.К.

Написание текста: Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Редактирование: Г.А.Ф.